在生命科學研究中，基因表達調控的分子機制一直是探索的熱點。

染色質免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）和 R-ChIP（RNA-DNA Hybrid Immunoprecipitation）作為兩種關鍵技術，分別從 DNA - 蛋白質和 RNA-DNA 互作層面揭示了表觀遺傳調控的奧秘。

本文將系統(tǒng)介紹這兩項技術原理、應用場景、實驗流程及注意事項，并探討納米抗體技術對其性能的革新。

R-ChIP 主要用于研究 RNA-DNA 雜交體（R-loop）的分布與功能，其原理與 ChIP 類似，但針對 RNA-DNA 互作進行了優(yōu)化：

2. R-ChIP 的獨特價值

· R-loop 功能研究：R-loop 在轉錄調控、DNA 損傷修復及基因組穩(wěn)定性中起關鍵作用。陳亮課題組利用 R-ChIP 發(fā)現 RNA 聚合酶停滯是 R-loop 形成的重要原因，并揭示了 GC 含量和 DNA 二級結構對 R-loop 動態(tài)變化的影響。

· 疾病機制探索：R-loop 異常與癌癥、神經退行性疾病相關。例如，在骨髓增生異常綜合癥（MDS）中，R-ChIP 發(fā)現剪接因子突變導致造血干細胞 R-loop 水平紊亂，影響基因組穩(wěn)定性。

· RNA 加工與穩(wěn)定性：結合 RNA-seq，研究 R-loop 對 RNA 剪接、轉運及降解的影響。例如，R-ChIP 揭示了 R-loop 在 mRNA 3' 端加工中的作用。

ChIP 實驗流程

1. 交聯

使用甲醛等交聯劑處理細胞或組織，讓蛋白質與 DNA 之間形成共價鍵，穩(wěn)定它們之間的相互作用，將蛋白質 - DNA 復合物固定下來，即便短暫的相互作用也能被捕獲。例如，對于哺乳動物細胞，常使用 1% 甲醛在室溫下交聯 10 - 15 分鐘，之后加入甘氨酸終止交聯反應。

2. 細胞裂解

通過去污劑溶液溶解細胞膜，使交聯的蛋白 - DNA 復合物從細胞或組織中釋放到溶液里 。此步驟可去除胞漿蛋白，降低背景信號 ，提高實驗靈敏度。通常不建議機械裂解細胞，可使用如 Thermo Scientific Pierce 染色質制備模塊等試劑，分離核組分與其他細胞成分 。

3. 染色質片段化

將提取的染色質剪切成較小的片段 ，理想范圍在 200 - 1000bp 。常用方法有機械超聲波處理或微球菌核酸酶（MNase）消化 。超聲波能產生隨機片段，但需專用設備，且要注意控制溫度等；微球菌核酸酶消化可重復性高，更適合處理多個樣本 ，不過酶活性變化等因素可能導致結果有變異 。

4. 免疫沉淀

抗體選擇：挑選合適的 ChIP 驗證抗體 ，這是實驗成功的關鍵。對于哺乳動物樣本，有多種 ChIP 級抗體可選；若靶蛋白無合格抗體，可表達 HA、myc 或 GST 等融合蛋白 ，再用針對親和標記的抗體進行免疫沉淀 。

孵育結合：將抗體與 Protein A/G 微珠等結合 ，隨后與細胞裂解液孵育，形成 “微珠 - 抗體 - DNA 結合蛋白 - DNA” 復合物 ，從而選擇性富集目標蛋白質 - DNA 復合物 ，去除其他無關細胞材料 。

洗滌雜質：用低鹽、高鹽、LiCl 等洗滌緩沖液依次洗滌微珠 ，去除非特異性結合的雜質 。

5. 解交聯與 DNA 回收

解交聯：通過廣泛熱孵育（如 62 - 65°C 孵育一定時間 ）或蛋白酶 K 消化蛋白質組分 ，斷開蛋白質與 DNA 之間的交聯 。

DNA 回收：采用酚氯仿結合標準 DNA 純化方法 ，或使用專門的純化柱，從蛋白質片段中分離并回收 DNA 。

6. DNA 分析

運用 PCR、qPCR 或測序（如 ChIP - seq ）等技術 ，對回收的 DNA 進行分析 ，鑒定蛋白質結合的特定 DNA 區(qū)域 ，定量分析蛋白質 - DNA 相互作用 。

ChIP 注意事項

· 抗體選擇：優(yōu)先使用 ChIP 級抗體，通過 ChIP-western 驗證其特異性。避免使用僅適用于 WB 或 IHC 的抗體，因其可能無法識別交聯后的表位。

· 交聯優(yōu)化：過度交聯會降低抗體結合效率，建議通過甲醛濃度梯度實驗確定最佳條件。例如，某些細胞系可能需要縮短交聯時間至 5 分鐘。

· 片段化控制：超聲功率和時間需根據細胞類型優(yōu)化，避免片段過長（>1.5 kbp）或過短（<500 bp）。酶法消化（如 MNase）可產生更均一的片段，適用于低輸入樣本。

R-ChIP 注意事項

· RNaseH1 活性驗證：確保 RHΔ 無催化活性，避免降解 RNA-DNA 雜合體?？赏ㄟ^體外酶切實驗驗證，如使用放射性標記的 RNA-DNA 底物檢測切割活性。

· 背景控制：使用陰性對照（如空載細胞）排除非特異性結合，同時設置 IgG 對照組。此外，可通過 RNAse A 處理樣本，驗證信號是否依賴 RNA-DNA 雜合體。

· RNA 保護：全程使用 RNase 抑制劑（如 RNasin），避免 RNA 降解影響實驗結果。在裂解液和洗滌緩沖液中均需添加抑制劑。

傳統(tǒng) ChIP/R-ChIP 依賴多克隆或單克隆抗體，存在批次差異、背景高等問題。納米抗體技術的引入徹底改變了這一局面：

技術應用實例：納米抗體偶聯產品在頂尖科研中的驗證

值得關注的是，我們的產品Anti-GFP Magarose beads（KTSM1334）已在國際權威期刊《Nucleic Acids Research》的研究中得到成功應用。在題為《METTL3-mediated m6A modification stabilizes TERRA and maintains telomere stability》的論文中，研究團隊通過 ChIP 實驗揭示了 METTL3 蛋白通過 m6A 修飾調控端粒相關 RNA（TERRA）穩(wěn)定性的機制。

論文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac1027

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結語

ChIP 和 R-ChIP 技術為研究染色質水平的基因表達調控提供了強有力的工具。隨著納米抗體技術的引入，尤其是高質量納米抗體瓊脂糖珠偶聯物的應用，使得 ChIP/R-ChIP 實驗在特異性、靈敏度和可重復性方面獲得了顯著提升。

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